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临床基因扩增检验乐虎国际app下载工作规范

临床基因扩增检验乐虎国际app下载工作规范

为使基因扩增检验技术有效地应用于临床,更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务,保证检验质量,特制定本规范。

一、临床基因扩增检验乐虎国际app下载的规范化设置及其管理

临床基因扩增检验乐虎国际app下载的规范化设置详见《临床基因扩增检验乐虎国际app下载管理暂行办法》(卫医发[2002]10号文)附件《临床基因扩增检验乐虎国际app下载基本设置标准》。为避免污染,必须严格遵循《临床基因扩增检验乐虎国际app下载设置标准》设置临床基因扩增检验乐虎国际app下载。

临床基因扩增检验乐虎国际app下载四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区域都必须有明确的标记,以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序,即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区,避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服,以便于鉴别。此外,当工作者离开工作区时,不得将各区特定的工作服带出。

清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因,因此乐虎国际app下载的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。

()试剂贮存和准备区

下述操作在该区进行:贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。

贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区,不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前,应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后,应将其分装贮存备用,避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。

含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂,应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在乐虎国际app下载内一次测定所需的扩增反应数来决定。

主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查,评价结果必须有书面报告。对于"热启动"技术(在第一个高温变性步骤后加入酶),聚合酶也可不包含在主反应混合液中。在整个本区的实验操作过程中,操作者必须戴手套,并经常更换。此外,操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。

严禁用嘴吸取液体,加样器和吸头等必须经高压处理。

 

<PCR乐虎国际app下载建设>PCR乐虎国际app下载的建立

为了对以个特定序列进行PCR做重复检测,需要三个不同的区域,每一个区域的具体技术操作和试剂在下面详细列出.
1、样品准备区
这个区域专门用作样品的准备,在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采
取预防措施:
1)PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。

2)组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理,以根据应用的需要提取DNA或RNA。
3)用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列。
4)DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作,以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。
5)大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。
6)管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生,而且管子不能用力崩开,这样会产生气溶胶。
7)任何时候都应该穿实验服和带手套,手套要经常更换,尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间,经常清洗。
2、样品准备和RNA-PCR
RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作,这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题,反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。
3、前PCR区
必须有专门用于准备各种反应的区域,这个区域必须保持干净,而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备,特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。
4、PCR乐虎国际app下载试剂的操作
1)所用的所有溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。
2)所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的-新鲜蒸馏的去离子水,用0.22μm过滤的,并且是高压灭菌。
3)在20℃25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂,在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。
4)所用试剂都应该以大体积配制,实验一下看试剂是否满意,然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。
5)所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。
6)新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。
7)样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。
5、在前PCR区建立PCR混合物
1)可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃4℃,在乐虎国际app下载只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。
2)如果你的乐虎国际app下载使用多套引物,以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济,可以考虑分装保存够一天的PCR成分。
3)作为一个规则,应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且,你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。
4)阴性样品要与每组样品同时做,以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染,阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。
5)当做阳性对照时,有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。

6)由于必须有对照反应,对照模板的特点应该予以考虑。
6、控制污染的方法
已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染—使用UNG,这一技术能有效地消除由PCR产物引起的污染。

<PCR乐虎国际app下载建设>标准的PCR乐虎国际app下载建设方案

1、主体结构:
主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝,从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固,线条简明,美观大方,密封性好。
2、标准的三区分隔和气压调节:
将PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区, 同时各区通过气压调节,使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。
可打开缓冲区Ⅰ,缓冲区Ⅱ和 PCR 扩增区的排风扇往外排气,在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口,空气通过回风口向室内换气。
3、消毒:
在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯,供消毒用。
在试剂准备区和标本制备区 还设置移动紫外线灯,对实验桌进行局部消毒。
4、机械连锁不锈钢传递窗:
试剂和标本通过机械连锁不锈钢(不建议使用电子连锁方式)传递窗传递,保证试剂和标本在传递过程中不受污染(人物分流)。
5、地面
地面建议使用PVC卷材地面或自流坪地面,整体性好。便于进行清扫,耐腐蚀。没有条件的也可采用水磨石地面,或大块的瓷砖(至少800mm×800mm)接缝需要小于2mm
6、照明
灯具要选用净化灯具,能达到便于清洗、不积尘的特点。

在建设的过程中应注意:
●规范的安装流程和全面的服务流程。
●严格按照规范科学设计的安装流程。
●安装前需要确定以下安装条件,如:电源电压,电源进线位置,电话网络线进线位置,进水水压,最小安装空间,地面平整度,通风孔、进水管和下水管的位置等,理想状态的空间尺寸和通风口尺寸。

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